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第三代測序技術是指單分子實時測序技術，也叫從頭測序技術。與前兩代測序技術相比，其最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。就當前形勢來看，第二代短讀長測序技術在測序市場上仍然占有絕對優勢，但第三代測序技術近年來也發展的如火如荼，且已應用于基因組測序、甲基化研究和突變鑒定等多個研究領域。

目前主要的第三代測序技術根據測序原理的不同可分成：

1. 納米孔電信號測序：牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)的納米孔單分子測序(Single-molecule nanopore DNA sequencing)技術；

2. 單分子熒光信號測序：① 美國太平洋公司(Pacific Biosciences,PacBio)的單分子實時測序(Single molecule realtime,SMRT)技術；② Helicos Biosciences公司的單分子測序(True single molecular sequencing,tSMS)技術。

一、Nanopore測序

納米孔測序，顧名思義，核心就是利用一個納米孔，孔內共價結合有分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，再利用動力蛋白牽引核酸穿過納米孔。當核酸通過納米孔時使電荷發生變化，從而引起電阻膜上電流的變化。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，而ATCG單個堿基的帶電性質不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時對電流產生的干擾不同，通過實時監測并解碼這些電流信號便可確定堿基序列，從而實現測序。

測序過程：

1. 基因組片段化：首先對基因組DNA進行片段化，打斷這個步驟是可選的，當起始的DNA量不足時可以對DNA進行打斷，能夠提高DNA分子的數量，達到提高數據產出的目的。

2. DNA修復：分為FFPE修復和末端修復。FFPE修復識別無堿基位點并切割DNA骨架，用正確的堿基補平缺失的堿基。FFPE修復的酶是Bst DNA聚合酶，它能夠補齊5’突出端，但不會切除3’突出末端。末端修復是把粘性末端修復為平末端，3’端加A，以便進行后面的連接反應。

3. 接頭連接：T4 DNA連接酶，通過TA連接的方法加上由ONT提供的測序接頭。

4. 上機測序

特點：

1. 長讀長：Reads可達Mb；

2. 設備成本低：測序芯片可清洗再生，重復利用；

3. 實時獲得序列信息：最快可在1小時內完成測序流程及數據分析，滿足動態檢測宏基因組需求；

4. 便攜式測序裝置：重量輕且占用空間小，可以隨身攜帶隨時測序；

5. 直接測序：直接測序原始DNA和RNA，不需要進行PCR擴增，避免了擴增偏好性；保留了原始堿基修飾信息，能夠直接讀出甲基化的胞嘧啶。

二、Pacbio測序

SMRT測序采用四色熒光標記的dNTP和ZMW孔完成了對單個DNA分子的測序。每個ZMW孔中，單個DNA分子模板與引物結合，然后結合DNA聚合酶后，被固定到ZMW孔底部。加入四色熒光標記的dNTP，DNA合成開始，連接上的dNTP會由于堿基配對在ZMW底部停留較長時間，激發后發出對應的熒光信號被識別，返回的熒光信號會形成一個特殊的脈沖波。另一方面由于熒光信號連接在dNTP的磷酸基團上，當上一個dNTP合成后，磷酸基團自動脫落，保證了檢測的連續性，提高了檢測速度，每秒鐘合成3個堿基的速度，配上高分辨率的光學檢測系統，實現了實時檢測。

1、Pacbio測序流程

1．1、樣本質檢

在整個建庫及測序過程中，不需要對樣品DNA進行PCR的擴增，實現了對每一條單分子DNA的測序，所以測序結果的好壞在很大程度上取決于樣品的質量，因此，對樣品DNA質量的檢測顯得尤為重要。主要包括以下兩方面的檢測:

1) 濃度檢測：以Qubit檢測的DNA濃度為標準（包括后續的整個建庫過程）， Nanodrop輔助檢測（要求OD260/280在1.8-2.0之間）。若Nanodrop測的值大于Qubit值的兩倍，表明樣品所含雜質較高，在建庫之前需要對樣品進行純化；假如兩者測的值相差不大，一般可直接進行打斷建庫。

2) 電泳檢測：進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的完整性。

1.2、建庫

1.3、BluePippin片段篩選

PacBio測序的一個最大優點是具有超長的讀長，文庫片段的大小直接影響著測序結果的平均長度，因此，為了提高測序質量，獲得更長的平均插入片段，需要對文庫進行BluePippin （BP）片段選擇，以去除短片段的文庫分子。

1.4、上機測序

通過BluePippin篩選后的文庫，在庫檢及格后，根據片段大小，利用diffusion和magbead兩種loading方式進行測序。

2、測序優勢：

1) 超長測序讀長

2) 超高的準確性

3) 均一覆蓋度：PacBio測序過程完全模擬了生物體內DNA的合成過程，無擴增和任何偏好性。隨著GC含量的變化，每個堿基的覆蓋率都基本保持一致。大大解決了二代測序中GC區難以跨越的問題，促進了高GC含量物種的測序研究。

4) 直接檢測表觀修飾：PacBio測序另外一大亮點就是，在測序的同時能夠直接檢測堿基修飾。堿基合成過程中，四色標記的dNTP釋放特定的熒光信號，并對應特定的脈沖信號。當堿基帶有特定修飾時，相鄰兩個堿基的脈沖信號就會出現一個對應的時間間隔（Interpulse Duration，IPD），根據IPD值就可以判定出堿基修飾類型。

3、靶基因基因測序

還可以利用單分子實時測序（SMRT Cell）的方法對 marker 基因進行測序（比如16S全長測序），之后通過對 CCS（Circular Consensus Sequencing）序列過濾，得到 Optimization-CCS 進行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構成；進一步進行α多樣性分析（Alpha Diversity）、β多樣性分析（Beta Diversity）和顯著物種差異分析等等，可以挖掘樣品之間的差異。